中药经历采收加工、炮制及制药工艺过程的物质传递和化学变化，最终以复方制剂的形式通过药物传输过程发挥临床疗效，而汤剂是主要的应用形式。中药质量标志物（）概念着眼于中药生产全过程中物质基础的特有、差异、动态变化和质量的传递性、溯源性，建立识别的第一步就是要系统地辨识中药形成过程中各环节化学物质组及传递变化的规律，通过特征图谱建立定性检测的新方法，结合化学计量学分析，为中药全程质量控制提供方法和参考的干燥根，其气微，味微苦、酸，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效，为临床常用中药年版仅采用单一成分芍药苷作为其质量控制标准，难以全面评价白芍质量以及临床应用。为逐步提升白芍质量评价体系，本团队在安徽省亳州市年重大科学技术专项“基于中药质量标志物的亳白芍生产全过程质量控制体系构建及其产业化示范”支撑下，系统开展白芍的研究。研究初步筛选出白芍中芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷、儿茶素、种类型样品的共有峰进行相似性和差异性分析，筛选出白芍生产的全部过程的共有物质基础，再结合各成分在药材

  Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括二元泵，自动进样器，G1316B、DAD检测器，G1314F色谱工作站，安捷伦科技有限公司；MCM36型赛多利斯Sartorius百万分之一电子天平，德国Sartorius公司；JK-300DB型数控超声波清洗器，上海望标仪器有限公司。

  对照品没食子酸（批号C17D10C105977，质量分数≥98%）、氧化芍药苷（批号M19S10S97994，质量分数≥98%）、儿茶素（批号P02A9F57645，质量分数≥98%）、芍药内酯苷（批号P26N11F132310，质量分数≥91.4%）、芍药苷（批号X12A8C33672，质量分数≥98%），购自上海源叶生物科技有限公司；对照品PGG（批号21052707，质量分数≥98.15%）、苯甲酰芍药苷（批号21091008，质量分数≥98.4%），购自成都普菲德生物技术有限公司；对照品没食子酰芍药苷（批号P02D7F26004，质量分数≥98%），购自成都德斯特生物技术有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国TEDIA公司；水为娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；分析纯乙醇、磷酸均购自国药集团化学试剂有限公司。

  2021年10月于安徽省亳州市谯城区十八里镇普康中药材种植基地采集10批亳白芍鲜药材，经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定，10批白芍鲜药材均为毛茛科芍药属植物芍药P. lactifloraPall.的干燥根。按照传统加工方法，将鲜白芍洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮，晒干加工为白芍药材；白芍药材经润透软化，切薄片，干燥加工为白芍饮片；取白芍饮片100 g，加7倍量水，浸泡30 min，加热回流60 min，趁热滤过，药渣加6倍量水加热回流40 min，合并2次滤液，浓缩定容至500 mL，即得质量浓度为0.2 g/mL的白芍标准汤剂[6-7]；备用。

  精密称取对照品没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、PGG和苯甲酰芍药苷适量于25 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，得质量分数分别为48.048、139.132、46.606、25.711、13.958、72.856、27.867、68.635 μg/mL的混合对照品溶液。

  精密称定各批次白芍药材、饮片样品粉末（过四号筛）0.5 g，置25 mL量瓶中，加入15 mL稀乙醇，超声处理（功率240 W、频率45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇定容至刻度，摇匀，以0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，得白芍药材供试品溶液（S1～S10），白芍饮片供试品溶液（Y11～Y20）。

  取白芍标准汤剂1 mL，加甲醇定容至10 mL，摇匀，静置20 min，分出上清液，以0.45 μm有机滤膜滤过，即得标准汤剂供试品溶液（B21～B30）。

  2.5.1精密度考察取白芍药材样品（S1）供试品溶液，按“2.4”项色谱条件重复进样6次，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.04%～0.38%，相对峰面积的RSD为0.51%～1.08%，根据结果得出仪器精密度良好。

  2.5.2稳定性考察取同一白芍药材样品（S1）供试品溶液，按“2.4”项色谱条件分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.08%～0.45%，相对峰面积的RSD为0.37%～1.29%，根据结果得出供试品溶液在24 h内稳定性良好。

  2.5.3重复性考察取同一白芍药材样品（S1）6份，按“2.2”项方法制备成供试品溶液，按“2.4”项色谱条件进行含量测定，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.05%～0.42%，相对峰面积的RSD为0.51%～1.49%，根据结果得出该方法重复性良好。

  2.6.1白芍特征图谱的建立分别精密称取白芍药材、饮片、标准汤剂样品，按“2.2”和“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定，记录色谱图。将10批白芍药材（S1～S10）的HPLC色谱图以AIA文件格式依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）”软件，以S1为参照图谱，多点校正法进行匹配，以中位数法生成白芍药材对照图谱（R1）。白芍饮片、标准汤剂的对照图谱建立同药材，对照图谱分别为R2、R3。将30批白芍样品的HPLC色谱图依次导入，生成白芍样品对照图谱（R）。样品叠加图谱见图1，对照图谱见图2。

  2.6.2特征峰的指认通过一系列分析确定10批白芍药材、饮片、标准汤剂的共有峰有9个，经与混合对照品色谱图（图3）比对，指认其中8个特征峰：1号峰为没食子酸，2号峰为氧化芍药苷，3号峰为儿茶素，4号峰为芍药内酯苷，5号峰为芍药苷，6号峰为没食子酰芍药苷，7号峰为PGG，8号峰为苯甲酰芍药苷。在30批白芍样品特征图谱中，5号峰的分离度大、对称性良好、峰面积较大且为所有样品共有，因此选取5号峰（芍药苷）作为参照峰（s），其保留峰面积为1，计算30批白芍样品各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。30批白芍样品的9个共有峰相对保留时间的RSD均小于2.00%，相对峰面积的RSD为14.58%～76.45%，说明不同批次样品中各成分含量有差异，存在传递性差异。相对峰面积结果见表1。

  2.6.3相似度评价将白芍药材、饮片、标准汤剂和30批总样品的图谱数据分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）”软件，生成相对应的对照图谱，计算各色谱图组内的相似度，相似度结果见表2。结果显示，白芍药材与饮片之间的相似度为0.976～0.982，白芍饮片与标准汤剂之间的相似度为0.968～0.973，白芍药材与标准汤剂之间的相似度为0.946～0.975，白芍总样品之间的相似度为0.935～0.984，说明白芍在生产的全部过程中各阶段样品差异不大。采用相似度评价虽能较好地反映生产的全部过程中各阶段样品特征图谱中主要峰群的相似程度，但从白芍相似度结果并不能体现出白芍生产的全部过程的差异性，因此，要进一步采用化学计量学分析其共有峰的差异。

  2.6.4正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）将白芍药材、饮片、标准汤剂样品的9个共有峰相对峰面积导入SIMCA 14.1软件，采用OPLS-DA方法对白芍生产药材、饮片、标准汤剂的组间差异做多元化的分析。在建立的OPLS-DA模型中R2Xcum＝0.963，R2Ycum＝1，Q2cum＝0.94，均大于0.5，说明建立的OPLS-DA模型解释率和预测力可靠、良好。OPLS-DA得分图显示，30批样品分为3组，药材、饮片、标准汤剂各为一组，结合变量重要性投影值（variable importance projection，VIP，图4）可知，9号峰的VIP＞1，说明9号峰在不一样样品中的含量差异较大，是白芍生产的全部过程中的差异性成分。

  由“2.6”项化学计量学结果可知，9号峰相对峰面积RSD值为76.45%，标准汤剂中的相对峰面积相当于药材的97.91%、相当于饮片的19.72%、且是VIP＞1的差异性成分，根据Q-Marker的“五要素”要求，为体现中药成分的专属性、传递性[8-9]，9号峰不适合作为白芍生产的全部过程中标准控制的特征指标。没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、PGG、苯甲酰芍药苷8种成分是白芍生产的全部过程能稳定传递的物质基础，与徐佳新[5]预测分析的Q-Marker基本一致。在此基础上，再结合各成分在药材-饮片-标准汤剂传递过程的含量变动情况，深入探究该8种成分在生产的全部过程中的传递情况，依据Q-Marker“五原则”，综合筛选确定白芍Q-Marker。

  2.7.1线性关系考察分别取适量的8种成分对照品，用70%甲醇溶解定容，并将其稀释成5个梯度，取各梯度对照品溶液10 μL，按照“2.4”项下色谱条件分别进样，记录其峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，建立各成分的标准曲线种成分的回归方程，结果分别为没食子酸Y＝20.874 X＋5.891 3，r＝0.999 8，线 μg/mL；氧化芍药苷Y＝12.064 X－0.303 1，r＝0.999 9，线 μg/mL；儿茶素Y＝22.33 X－0.612 9，r＝0.999 9，线 μg/mL；芍药内酯苷Y＝11.042 X＋3.242 3，r＝0.999 9，线 μg/mL；芍药苷Y＝12.770 X＋37.471，r＝0.999 8，线μg/mL；没食子酰芍药苷Y＝13.185 X－1.172 7，r＝0.999 9，线 μg/mL；PGG Y＝19.902 X－14.585，r＝0.999 8，线 μg/mL；苯甲酰芍药苷Y＝19.614 X－1.023 9，r＝0.999 9，线 μg/mL。2.7.2精密度考察取混合对照品溶液，按“2.4”项色谱条件重复进样6次，测得没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、PGG和苯甲酰芍药苷峰面积的RSD分别为0.59%、0.24%、1.56%、0.69%、0.83%、0.61%

  2.53%、0.38%，根据结果得出仪器精密度良好。2.7.3稳定性考察取同一白芍药材样品（S1）供试品溶液，按“2.4”项色谱条件分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，记录峰面积。结果显示，白芍饮片中没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、PGG和苯甲酰芍药苷峰面积的RSD

  1.92%、1.18%、1.64%、0.95%、0.29%、0.84%、1.74%、0.22%，根据结果得出供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.7.4重复性考察取同一白芍药材样品（S1）6份，按“2.2”项方法制备成供试品溶液，按“2.4”项色谱条件进行含量测定，白芍饮片中没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、PGG和苯甲酰芍药苷质量分数的RSD依次为1.23%、1.10%、0.48%、1.48%

  0.79%、0.65%、1.11%、0.80%，根据结果得出该方法重复性良好。2.7.5加样回收率考察精密称取已知测定含量的白芍药材样品（S1）粉末约0.25 g，每份精密加入相当于0.25 g样品含量的6种对照品溶液，按“2.2”项下方法操作制备供试品溶液，按“2.4”项中色谱条件进样分析，计算回收率及RSD。结果白芍药材样品中没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、PGG和苯甲酰芍药苷的平均加样回收率分别为96.08%、100.01%

  90.96%、100.32%、98.81%、99.74%、92.45%、90.25%，RSD分别为0.32%、0.46%、1.59%、0.26%、1.07%、0.31%、1.54%、0.37%，说明该方法准确度较好。2.7.6白芍药材-饮片-标准汤剂8种成分含量测定及转移率分析根据“2.2”“2.3”项下方法制备白芍药材、饮片、标准汤剂供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样，记录数据，测得白芍药材、饮片、标准汤剂中没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、PGG和苯甲酰芍药苷的质量分数。根据如下公式计算白芍8个成分转移率[10]。

  -白芍饮片转移率＝白芍饮片中指标成分的含量/白芍药材中指标成分的含量白芍饮片-白芍标准汤剂转移率＝白芍标准汤剂中指标成分的含量/白芍饮片中指标成分的含量10批白芍药材、饮片、标准汤剂中8种成分的平均含量见表3，平均转移率结果见表4。结果显示，白芍药材-

  -标准汤剂传递过程中，芍药苷、芍药内酯苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜及其苷类成分平均转移率均大于60%，显示此5

  200%，未能充分显示白芍饮片中没食子酸的传递情况；儿茶素和PGG 2种成分含量较低且转移率小于25%。依据中药Q-Marker质量传递与溯源、化学成分特有性、有效性、可测性以及复方配伍环境等原则，没食子酸、儿茶素和PGG 3种成分在饮片-标准汤剂过程中不能稳定传递，故不适合作为白芍Q-Marker，而芍药苷、芍药内酯苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜及其苷类成分从药材到标准汤剂过程中一直稳定传递，表明这些成分能在某些特定的程度上体现生产的全部过程对白芍质量的影响。3讨论本实验建立了白芍药材、饮片、标准汤剂和30批白芍总样品的特征图谱，共9个共有峰，采用OPLS-DA

  批样品的9个共有峰峰面积进行化学计量学分析，结果显示芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、氧化芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷、PGG、儿茶素8

  -标准汤剂过程中传递，9号峰不适合作为白芍生产的全部过程中标准控制的特征指标；通过药材-饮片-标准汤剂过程中8种可传递成分的含量和转移率变动情况分析，芍药苷、芍药内酯苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜及其苷类成分含量稳定，在药材-饮片-标准汤剂过程中平均转移率均大于60%，可以稳定传递。文献资料显示，白芍中芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷5种单萜苷类成分具有保肝、抗抑郁、抗炎镇痛、神经保护等药理作用，是白芍的药效物质基础，也是白芍药对和方剂中的入血成分[11-14]，体现了Q-Marker的质量传递与溯源、化学成分特有性、有效性、可测性以及复方配伍环境“五原则”要求，5种成分可当作白芍Q-Marker。然而，白芍饮片-标准汤剂传递过程中，没食子酸平均转移率为225.17%，PGG平均转移率为21.57%，且2种成分在药材-饮片-标准汤剂过程中转移率标准偏差大于30%

  ，不能稳定传递，可能原因是PGG在白芍样品制备和贮藏过程中不稳定，会逐步向1,2,3,6- O -四没食子酰葡萄糖和没食子酸等成分进行转化[15-18]。儿茶素在煎煮过程中易受热分解[19]，在白芍饮片-标准汤剂传递过程中平均转移率为23.87%，标准汤剂中含量仅为0.02%，属于微量成分。由于煎煮过程中没食子酸、儿茶素和PGG等鞣质类成分易发生水解、氧化、聚合以及分解等反应，导致鞣质类成分在饮片-标准汤剂传递过程中含量变化较大不能稳定传递，因此，没食子酸、儿茶素和PGG 3种成分不适合作为白芍的Q-Marker

  。本实验在前期白芍Q-Marker预测的基础上，进一步建立白芍药材、饮片、标准汤剂HPLC特征图谱对白芍生产的全部过程的共有峰进行定性分析，深入探究该8种成分在白芍药材-饮片-标准汤剂过程的质量传递情况，依据Q-Marker“五原则”[20]综合筛选确定白芍Q-Marker，为白芍饮片标准质量的科学评价提供科学依据，也为中药